پایان نامه بررسی روند تجزیه شیمیایی و زیستی علف کش متری بیوزین در خاک و ارزیابی حساسیت گیاهان به آن

پایان نامه کارشناسی ارشد

عنوان :بررسی روند تجزیه شیمیایی و زیستی علف کش متری بیوزین در خاک و ارزیابی حساسیت برخی از گیاهان زراعی به بقایای آن

با فرمت قابل ویرایش word

تعداد صفحات: 110  صفحه

تکه های از متن به عنوان نمونه :

عنوان                                                         فهرست مطالب	صفحه
1-مقدمه ...............................................................................................................................................................	1
2-بررسی منابع   ..................................................................................................................................................	5
2-1-علف کش ها و آلودگی های زیست محیطی آن ها ..............................................................................	5
2-2- علف کش متری بیوزین ......................................................................................................................	7
2-2-1- خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ....................................................................................................	7
2-2-2- متابولیت های علف کش متری بیوزین ............................................................................................	8
2-3- سرنوشت علف کش ها .........................................................................................................................	9
2-3-1- فرایند های فیزیکی.........................................................................................................................	9
2-3-1-1- جذب توسط گیاه   ...............................................................................................................	9
2-3-1-2- جذب توسط ذرات خاک     .......................................................................................................	10
2-3-1-3- تبخیر و تصعید   ........................................................................................................................	12
2-3-1-4-رواناب........................................................................................................................................	13
2-3-1-5- آبشویی .................................................................................................................................	13
2-3-2- فرایند های بیولوژیکی موثر در سرنوشت آفت کش ها   .....................................................................	15
2-3-2-1- تجزیه .......................................................................................................................................	15
2-4- تجزیه علف کش متری بیوزین در خاک ................................................................................................	16
2-4-1- تجزیه شیمیایی ...........................................................................................................................	16
2-4-2- تجزیه زیستی     ..................................................................................................................................	16
2-5- ماندگاری علف کش ها .............................................................................................................................	17
2-5-1- عوامل موثر در تجزیه و ماندگاری علف کش ها............................................................................	17
2-5-1-1- اسیدیته خاک ............................................................................................................................	17
2-5-1-2- دما و رطوبت خاک..................................................................................................................	18
2-5-1-3- مواد آلی و نقش آن ها در تجزیه علف کش ها......................................................................	20
2-5-2- ماند گاری علف کش ها در خاک و خسارت به گیاهان زراعی موجود در تناوب ..........................	21
2-6- آزمایشات زیست سنجی ...........................................................................................................................	24
3-مواد و روش ...................................................................................................................................................	27
3-1- آزمایش اول: بررسی تجزیه شیمیایی و زیستی علف کش متری بیوزین در خاک ................................	27
3-1-1- آماده سازی خاک ........................................................................................................................	28
3-1-2- تهیه ماده تکنیکال و تجاری متری بیوزین ...................................................................................	29
3-1-3- استخراج متری بیوزین از خاک..................................................................................................	29
3-1-4- دستگاه HPLC............................................................................................................................	30
3-1-5- واسنجی دستگاه HPLC و رسم منحنی استاندارد متری بیوزین  .............................................	30
3-1-6- بررسی کارایی استخراج متری بیوزین...........................................................................................	32
3-1-6- تجزیه آماری داده ها .....................................................................................................................	32
3-2- آزمایش دوم : ارزیابی حساسیت برخی از گیاهان زراعی به بقایای شبیه سازی شده علف کش متری بیوزین در خاک ................................................................................................................................................	34
3-2-1- آماده سازی خاک گلدان ها ........................................................................................................	34
3-2-2- کاشت گیاهان..............................................................................................................................	35
3-2-3- پارامتر های اندازه گیری شده......................................................................................................	35
3-2-4- تجزیه آماری داده ها ...................................................................................................................	36
4- نتایج و بحث ............................................................................................................................................	37
4-1- بررسی کارایی استخراج متری بیوزین در سطوح مختلف ماده آلی ...................................................	37
4-2- بررسی تجزیه متری بیوزین در خاک غیر سترون .................................................................................	37
4-2-1-1- اثر ماده آلی بر روند تجزیه و نیمه عمر متری بیوزین.......................................................	37
4-2-1-2- تاثیر طول دوره خوابانیدن نمونه ها بر تجزیه متری بیوزین..................................................	40
4-2-1-3- بررسی اثرات متقابل مواد آلی و زمانهای خوابانیدن نمونه ها ی خاک در تجزیه علف کش متری بیوزین..................................................................................................................................................	42
4-2-2- تجزیه متری بیوزین در خاک سترون شده......................................................................................	48
4-2-2-1- بررسی تاثیر کود آلی بر تجزیه متری بیوزین در خاک سترون شده .....................................	49
4-2-2-2- تاثیر زمان بر تجزیه علف کش ...........................................................................................	50
4-2-2-3- اثرات متقابل ماده آلی و زمان بر تجزیه متری بیوزین در خاک سترون ..............................	51
4-2-2-4- اثرات متقابل سترون کردن کود آلی و زمان بر تجزیه متری بیوزین....................................	52
4-2-2-5- اثرات متقابل کود آلی ، سترون کردن کود آلی و زمان بر تجزیه متری بیوزین ...................	53
4-2-3- مقایسه تجزیه متری بیوزین در خاک سترون شده و غیر سترون .................................................	60
4-3- بررسی بقایای شبیه سازی شده علف کش متری بیوزین در خاک بر گیاهان زراعی ..........................	63
4-3-1- تاثیر بقایای علف کش بر سبز شدن گیاهان زراعی....................................................................	63
4-3-2- تاثیر بقایای علف کش بر زیست توده و بقای گیاهان زراعی ..................................................	63
5-نتیجه گیری و پیشنهادات ...............................................................................................................................	75
5-1-نتیجه گیری کلی و پیشنهادات .............................................................................................................	75
6- منابع   ...........................................................................................................................................................	77
جدول 4-9-پارامتر های برآورده شده توسط معادله سینیتیکی درجه اول و طول عمر متری بیوزین در خاک و کود آلی سترون شده                                                                                                                   55 جدول 4-10-مقادیر tو مقایسات خطوط برازش داده شده در تیمار های خاک و کود آلی سترون شده           55 جدول 4-11- پارامتر های برآورده شده توسط معادله سینیتیکی درجه اول و طول عمر متری بیوزین در خاک و کود آلی غیر سترون شده                                                                                                       56 جدول 4-12-مقادیر tو مقایسات خطوط برازش داده شده در تیمار های خاک و کود آلی غیر سترون           56 جدول 4-13-مقایسه پارامتر های براورده شده حاصل از تجزیه متری بیوزین در تیمار های آزمایش و طول عمر های براورده شده آن                                                                                                             62 جدول 4-14-مقادیر tو مقایسات خطوط برازش داده شده در تیمار های مختلف خاک سترون و غیر سترون 62 جدول 4-15- میانگین مربعات مربوط به تاثیر بقایای شبیه سازی شده علف کش متری بیوزین در خاک بر درصد بقا، زیست توده اندام های هوایی و ریشه گیاهان                                                                     64 جدول 4-16- مقایسه میانگین درصد نسبت به شاهد وزن خشک زیست توده هوایی و ریشه و درصد بقای گیاهان زراعی در غلظت های مختلف بقایای متری بیوزین در خاک                                                   67 جدول 4-17- پارامتر های برآورده شده توسط معادلات سه و چهار پارامتری                                             71

چکیده

متری بیوزین یکی از مهم ترین علف کش های بازدارنده فتوسیستم ІІ و دارای ماندگاری متوسط به بالایی در خاک است. این مطالعه با هدف بررسی روند تجزیه شیمیایی و زیستی این علف کش در در خاک و ارزیابی خسارت بقایای احتمالی آن بر محصولات زراعی موجود درتناوب طی دو آزمایش جداگانه انجام شد. در آزمایش اول که در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی انجام شد، عوامل مورد بررسی در آن شامل مقدار ماده آلی خاک (کود گاوی ) در چهار سطح (0، 1، 5 و 10درصد وزنی خاک)، شرایط سترون خاک و ماده ی آلی در دو سطح (سترون شده و سترون نشده) و زمان برداشت نمونه ها در 7 سطح (صفر، 2، 4، 8، 16، 36، 64و 90 روز پس از خوابانیدن نمونه ها در انکوباتور) بودند که در قالب طرح کاملا تصادفی و در سه تکرار انجام شد. آزمایش دوم به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کامل تصادفی در چهار تکرار و به منظور بررسی حساسیت گیاهان زراعی به بقایای شبیه سازی شده متری بیوزین در خاک انجام شد. عوامل مورد بررسی در آن شامل هشت گیاه زراعی (لوبیا، عدس، نخود، ذرت، گندم ،جو، کلزا و چغندرقند) و غلظت های مختلف متری بیوزین در خاک در هفت سطح شامل (0، 016/0،  032/0، 064/0، 128/0، 16/0 میلی گرم در کیلوگرم خاک) بودند. بر مبنای نتایج آزمایش اول ، کاربرد سطوح مختلف ماده آلی (سترون و غیر سترون) در خاک سترون منجر به کاهش نیمه عمر متری بیوزین در مقایسه با شاهد شد اما از نظر آماری اختلافات در سطوح 1و 10 درصد معنادار نبود، اما با کاربرد 5 درصد ماده آلی سترون در این خاک نیمه عمر از 63/113روز(شاهد) به 34/51 روز کاهش یافت. وکاربرد همین سطح از کود آلی به صورت غیر سترون منجر به کاهش نیمه عمر متری بیوزین از 511/83 روز (شاهد)به 50/49 روز شد. نتایج مربوط به تجزیه متری بیوزین در خاک غیر سترون نیز نشان داد که مقدار کود آلی به کاربرده شده نقش موثری در کاهش نیمه عمر متری بیوزین دارد بطوریکه کم ترین نیمه عمر در این خاک در سطح 10درصد وزنی کود آلی در خاک (08/38روز )، مشاهده شد. نتایج آزمایش دوم نشان داد که بقایای متری بیوزین تاثیر معنی داری بر جوانه زنی گیاهان مذکور نداشت اما با افزایش غلظت متری بیوزین در خاک، وزن خشک تمام گیاهان به طور کاملا معنی داری کاهش پیداکرد .با توجه به  نتایج آزمایش ذرت با داشتن بالاترین ED₅₀ (19/0) به عنوان مقاومترین گیاه و کلزا با کم ترین مقدار ED₅₀ (012/0) به عنوان حساس ترین گیاه به بقایای متری بیوزین شناخته شدند و سایر گیاهان زراعی بر اساس شاخص  مذکور از نظر حساسیت به بقایای متری بیوزین به صورت: ذرت<لوبیا<نخود<عدس<گندم < جو<چغندرقند<کلزا طبقه بندی شدند.

واژه های کلیدی: باقیمانده:،زیست توده، حبوبات، نیمه عمر، متری بیوزین

مقدمه

   رشد روز افزون جمعیت و نیاز آنها به غذا و عدم امکان افزایش سطح زمین های زراعی منجر به استفاده از عواملی در تولید محصولات زراعی شده است که عملکرد آن ها را در واحد سطح افزایش دهند. در این ارتباط، استفاده از آفت کش ها از مهم ترین عواملی هستند که با هدف حفاظت از محصولات زراعی به کار می روند(بولک، 2005). به رغم استفاده گسترده از آفت کش ها تحقیقات نشان داده اند که فقط 1 درصد از آن ها به جایگاه عمل در گیاه می رسند و حدود 9/99 درصد ازآن ها باز می مانند یعنی بخش اعظمی از علف کش ها در محیط رها شده و تبعات زیست محیطی وسیعی را به دنبال خواهد داشت(پیمنتال، 1986). اهمیت این موضوع برای علف کش ها که از مهم ترین و پرکاربردترین آفت کش ها در کشاورزی اند(لین، 2003)، درخور توجه می باشد. از مهم ترین تبعات رها شدن علف کش ها در محیط، ماندگاری آن ها درخاک است(زند و همکاران، 1387).این مساله، ضمن اثرات زیان بار بر فعالیت ریزموجودات و پایداری اکوسیستم خاک، منجر به خسارت در محصولات زراعی موجود در تناوب  نیز می شود و آبشویی تدریجی و رواناب آنها تهدیدی جدی برای آلودگی آب های زیرزمینی و جاری می باشد(کجار، 2001; فن، 2009). این مهم به ویژه درعلف کش های تریازین ها و تریازینون ها که خاک کاربرد بوده و خاک  مخزن اصلی نگهداری آن هاست (فوسکادو، 1999) اهمیت بیشتری دارد. در بین این علف کش ها متری بیوزین از مهم ترین گروه تریازینون هاو از بازدارندگان فتوسیستم Π می باشد که به طور گسترده ای در کنترل علف های هرز پهن برگ و باریک برگ بسیاری از محصولات زراعی از جمله سیب زمینی ،گوجه فرنگی و گندم به کار می رود. بر اساس اطلاعات موجود، این علف کش جزء علف کش های با ماندگاری متوسط و بالا در خاک محسوب می شود و از پتانسیل بالایی در آلودگی منابع آب های زیرزمینی و نیز  آسیب به گیاهان زراعی موجود در تناوب برخوردار است.(راتچ، 1986; سینق، 2008). از این رو ارائه راهکارهایی در جهت کاهش زیان بار آن ضروری است. در این راستا توجه به عوامل موثر در سرنوشت علف کش ها در خاک، بویژه تجزیه شیمیایی، تجزیه زیستی، تبخیر، تصعید، آبشویی، رواناب سطحی و جذب توسط ذرات خاک و گیاه مهم و تعیین سهم هریک از عوامل مذکور در سرنوشت آفت کش ها نقش مهمی درمدیریت ماندگاری و بقایای آن ها دارد. از آن جا که بر اساس گزارش های موجود از بین تمام عوامل موثر بر سرنوشت علف کش ها در محیط نقش تجزیه شیمیایی و زیستی[1] هم تر است(بولک و همکاران، 2005). و با توجه به اینکه در ارتباط با ماندگاری علف کش متری بیوزین درخاک که از مهم ترین و پرکاربرد ترین علف کش ها در کشور است مطالعه ای صورت نگرفته است. این مطالعه با هدف بررسی روند و سهم  تجزیه شیمیایی و زیستی متری بیوزین در خاک های زراعی مشهد و خسارت احتمالی بقایای آن به محصولات زراعی موجود درتناوب انجام  شد.

فرضیه ها

 1-نیمه عمرمربوط به تجزیه زیستی و شیمیایی علف کش متری بیوزین در خاک متفاوت است.

2-افزایش محتوای مواد آلی خاک در سرعت تجریه و نیمه عمر علف کش متری بیوزین موثر است.

3-تجزیه و نیمه عمر متری بیوزین در خاک تابعی از جمعیت میکروبی خاک و محتوای مواد آلی آن است.

4-بقایای علف کش متری بیوزین تاثیر منفی بر رشد گیاهان زراعی در تناوب دارد.

5-گیاهان زراعی موجود در تناوب درجه تحمل متفاوتی به بقایای احتمالی علف کش متری بیوزین در خاک دارند.

 اهداف

1- تعیین نیمه عمر و سرعت تجزیه علف کش  متری بیوزین در خاک

2-ارزیابی نقش تجزیه زیستی و شیمیایی در سرنوشت علف کش متری بیوزین

3- بررسی نقش مواد آلی در تجزیه و نیمه عمر علف کش متری بیوزین در خاک

 4- بررسی درجه حساسیت گیاهان زراعی مختلف به بقایای شبیه سازی شده علف کش  متری بیوزین در خاک و تعیین گیاه یا گیاهان محک برای تعیین بقایای احتمالی آن در خا;

                                                                                                                           

پایان نامه بررسی ساختار تنوع ژنتیکی جمعیت های گندم نیای وحشی Aegilops crassa در ایران

پایان­نامه کارشناسی ارشد در رشته کشاورزی (اصلاح نباتات)

عنوان:

بررسی ساختار تنوع ژنتیکی جمعیت های گندم نیای وحشی Aegilops crassa در ایران با استفاده از نشانگرهای بین ریزماهواره ژنومی و صفات ریختی

با فرمت قابل ویرایش word

تعداد صفحات: 116  صفحه

تکه های از متن به عنوان نمونه :

چکیده

     گیاه Aegilops crassa ،دارای دو سیتوتیپ تتراپلوئید وهگزاپلوئید با ژنوم ( 2n=2x=28 M^crM^crD^cr1D^cr1 ) و (2n=6x=42 M^crM^crD^cr1D^cr1 D^cr2D^cr2  ) است. این گیاه  یکساله و متعلق به خانواده گرامینه و طایفه Triticeae می باشد. بررسی تنوع ژنتیکی در ژرم­پلاسم گیاهی پیش­نیاز هر برنامه­ی اصلاحی یا حفاظتی گیاهان است. این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی بین 16 جمعیت Ae.crassa با استفاده از 10 آغازگر ISSR انجام شد. DNA ژنومی از گونه­ها در مرحله­ی دو تا سه برگی به روش CTAB با اندکی تغییرات استخراج و نتایج تکثیر با آغازگرهای مختلف روی ژل آگاروز 5/1 درصد مشاهده شدند. باندهای تکثیر شده به صورت حضور باند (یک) و عدم حضور باند (صفر) امتیازدهی و با نرم­افزارهای مولکولی و آماری، تجزیه و تحلیل داده­ها  انجام گرفت. همچنین این آزمایش در قالب طرح آزمایشی اگمنت (در 3 بلوک) در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام انجام شد. از میان نمونه‌های ارزیابی شده سه نمونه که دارای بذر بیشتری بودند به عنوان شاهد استفاده شدند. نتایج تکثیر DNA ژنومی با استفاده از آغازگرهای ISSR، در مجموع 105 آلل تولید کرد که از این تعداد 86 آلل (9/81 درصد)، به عنوان آلل چندشکل تشخیص داده شد. اندازه آلل­های تکثیر شده از 190 (آغازگر UBC840) تا 1500 جفت باز (آغازگر 12،14) بود. محتوای اطلاعات چندشکلی از 17/0 در آغازگر UBC842 تا 34/0 برای آغازگر 12 متفاوت بود. همچنین با استفاده از نشانگر ISSR به ترتیب بیشترین و کم­ترین درصد باندهای چندشکل در جمعیت IUGB-00319 (05/39 درصد) و IUGB-01564 (48/10درصد) مشاهده گردید. جمعیت IUGB-00319 بالاترین شاخص تصحیح شده هتروژنی و میزان شاخص شانون را به خود اختصاص داد. آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که سطح بیشتری از تنوع به درون جمعیت­ها (53 درصد) تعلق داشت، درحالی که (47 درصد) تنوع در بین جمعیت­ها مشاهده گردید. همچنین تجزیه خوشه ای داده‌ها با استفاده از ماتریس شاخص Nei با الگوریتم Nj انجام شد. دندروگرام بدست آمده جمعیت­ها را به سه گروه و زیر گروه­هایی تقسیم نمود و تا حدی عدم ارتباط بین تنوع مولکولی و تنوع جغرافیایی را نشان داد. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که نشانگرهای ISSR برای ارزیابی میزان تنوع ژنتیکی در آژیلوپس کراسا مفید است.

کلیدواژه: نشانگرISSR، ، تنوع ژنتیکی، گونه Ae.crassa ، طرح آگمنت

فهرست مطالب

فهرست جدول­ها……………… ص

فهرست شکل­ها……… ط

فصل اول (مقدمه و اهداف)……….. 1

 1-1- مقدمه………….. 2

1-2- اهداف……….. 7

فصل دوم (کلیات و مرور منابع)…… 8

2-1- اهمیت منابع ژنتیکی.. 9

2-2- طبقه بندی منابع ژنتیکی گیاهی.. 9

2-2-1- گونه‌های وحشی.. 9

 2-2-2-گونه های زراعی.. 10

2-3- مناطق پراکنش جنس آژیلوپس.. 10

2-4- مناطق پراکنش گونه Ae.crassa. 11

2-5- طبقه بندی گونه Ae.crassa. 11

2-6- تنوع ژنتیکی و اهمیت شناخت آن .. 12

2-7- منشاء تنوع ژنتیکی……………………………………………………………..13

2-8- اهمیت بررسی تنوع ژنتیکی…. 13

2-9- کاربردهای بررسی تنوع ژنتیکی.. 14

2-9-1- بررسی­های فیلوژنتیکی…. 14

2-9-2- ژنتیک جمعیت………………. 14

2-9-3-مدیریت گیاهان وحشی………… 14

2-9-4- مدیریت منابع ژنتیکی……….. 15

2-9-4-1- کلکسیون های ذخائر ژنتیک گیاهی…… 15

2-9-4-1- کنترل بیماری­های گیاهی…….. 15

2-10- روش های ارزیابی تنوع ژنتیکی…… 16

2-11- نشانگرهای ژنتیکی….. 16

2-11-1- نشانگرهای مورفولوژیک.. 16

2-11-2- مزایا و معایب نشانگرهای مورفولوژیک.. 17

2-11-3- نشانگرهای مولکولی.. 18

2-11-3-1- خصوصیات مناسب یک نشانگر مولکولی.. 19

2-11-3- 2-اهمیت نشانگرهای مولکولی DNA.. 19

2-11-3-3- نشانگرهای بیوشیمیایی……………………………………… 20

2-11-3-4- نشانگرهای مبتنی بر DNA………………………………… 20

2-11-3-5- نشانگرهای DNA  غیر مبتنی بر PCR………… 21

2-11-3-6- نشانگرهای DNA  مبتنی بر PCR………………….. 22

2-11-3-7-  نشانگرهای DNA  مبتنی بر PCR  هدفمند و توالی یابی    22

2-12- نشانگرهای مولکولی ISSR……. 23

2-12-1- علل ایجاد چندشکلی حاصل از نشانگر مولکولی ISSR  25

2-12-1-1- نمونه DNA.. 25

2-12-1-2- ماهیت آغازگر.. 25

2-12-1-3- روش مورد استفاده برای تشخیص باندها.. 26

2-12-2- مزایای نشانگرهای ISSR.. 26

2-12-2-1- تکرارپذیری بسیار بالا.. 26

2-12-2-2- دقت بالا……….. 27

2-12-2-3- تنوع بالا……………… 27

2-12-2-4-  هزینه پایین…..27

2-12-2-5- سرعت و سهولت اجرا……. 27

2-12-3- معایب نشانگرهای ISSR……………. 27

2-12- 4- انواع نشانگرهای ISSR……. 28

2-12-4-1-تکنیک MP-PCR 28

2-12-4-2- تکنیک F-ISSR.. 28

2-12-5-کاربرد نشانگرهای مولکولی ISSR.. 29

2-12-5-1- انگشت­نگاری ژنومی .. 29

2-12-5-2-   مطالعات تنوع ژنتیکی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی   29

2-12-5-3-  نقشه­یابی ژنتیکی.. 30

2-12-5-4-  نشانمند کردن ژن و انتخاب به کمک نشانگر.. 30

2-12-5-5- مشخص کردن فراوانی توالی­های ریزماهواره­ای 30

2-12-5-6- کاربرد نشانگرهای  ISSR در شناسایی و رده­بندی گونه­ها   31

2-13- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی.. 31

2-14- تخمین فاصله ژنتیکی.. 32

2-14- 1- روش گروهبندی افراد یا جمعیت ها.. 32

2-14-1-1-تجزیه خوشه ای.. 33

2-14-1-2- تجزیه به مختصات اصلی (PCoA).. 34

2-14-2-  معیارهای سودمندی نشانگرها.. 34

2-14-2-1- محتوی اطلاعات چندشکلی.. 34

2-14-2-2-  احتمال همسانی.. 35

2-14-2-3-  قدرت تفکیک.. 35

2-15- مروری بر مطالعات ژنتیکی  و مورفولوژی انجام شده روی گونه های آژیلوپس.. 35

فصل سوم (مواد و روشها)…. 40

3 -1- مواد گیاهی.. 41

3-2- آغازگرها.. 43

3-3-  مکان و زمان انجام آزمایش مولکولی.. 43

3-4- عملیات زراعی.. 44

3 -4-1- مشخصات جغرافیایی محل انجام آزمایش مزرعه‌ای.. 44

3 -4- 2- طرح آزمایشی و مراحل اجرای آن.. 44

3 -5- استخراج DNA ژنومی.. 45

3-6- تعیین کمیت نمونه های DNA  ژنومی.. 47

3 -7- تعیین کیفیت نمونه های DNA ژنومی.. 48

3 -8- روش تهیه آگاروز 8/0و 5/1 درصد برای تعیین کمیت وکیفیت و تفکیک قطعات تکثیر شده.. 48

3-9- آماده سازی نمونه ها واجرای الکتروفورز ژل آگاروز   49

3-10- اجزای واکنش زنجیره ای پلیمراز.. 50

3-11- سیکل حرارتی و مراحل واکنش زنجیره­ای پلیمراز.. 50

3 -12-توان و زمان مورد نیاز برای الکتروفورز محصول PCR   51

3 -13- مواد تشکیل دهنده بافرTE.. 52

3-14- تهیه بافر  TAE10X.. 52

3 -15- اتیدیوم بروماید.. 53

3 -16- رنگ بارگذاری.. 53

3 -17- مراحل رنگ آمیزی تا ظاهرسازی قطعات تکثیر شده   53

3-18- تجزیه وتحلیل داده ها.. 54

3-18-1- امتیازبندی باندهای حاصل از داده های مولکولی   54

3-18-2- تجزیه خوشه ای و آنالیز مولکولی……..54

فصل چهارم(بحث و نتیجه­گیری)……55

 4-1- نتایج استخراج DNA ژنومی.. 56

4 -2- نتایج واکنش زنجیره­ای پلیمراز.. 56

4 -3- محاسبه چندشکلی نشانگرهای ISSR.. 58

4-4- محاسبه محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگرهای ISSR   59

4-5- محاسبه شاخص نشانگر(MI) نشانگرهای ISSR…………60

4 -5- محاسبه ضرایب همبستگی کوفنتیک.. 61

4-6- ترسیم دندروگرام جمعیت­های Ae.crassa. 62

4-7- تجزیه به مختصات اصلی با استفاده از نرم­افزار DARWin  وترسیم نمودار سه بعدی جمعیت­ها با نرم­افزار Minitab. 63

4-8- محاسبه فاصله ژنتیکی درون و بین جمعیت­های Ae.crassa. 64

4-9- محاسبه ماتریس فاصله و تشابه ژنتیکی شاخص Nei ………66

4 -10- میزان آلل­های چندشکل در جمعیت­های Ae.crassa. 69

4-11- محاسبه شاخص­های ژنتیکی در جمعیت­های Ae.crassa. 70

4 -12- تجزیه واریانس مولکولی.. 71

4-13- بررسی صفات مورفولوژی.. 72

4-13-1- همبستگی ساده فنوتیپی.. 72

4-13-2- تجزیه کلاستر (خوشه­ای)………….74

4-13-3- تجزیه به مولفه های اصلی.. 76

4 -13-4- تجزیه علیت (مسیر).. 78

4-14- نتیجه­گیری کلی مولکولی.. 80

4-15- نتیجه­گیری کلی مورفولوژیکی…..81

4-15-1 پیشنهادات.. 83

 منابع…..……84

مقدمه

ایران یکی از غنی ترین مراکز دنیا از نظر ذخایر ژنتیکی گیاهی محسوب می‌شود. به عقیده گیاهشناسان ایرانی حدود 10 الی 12 هزار گونه گیاهی در ایران وجود دارد که آن را به عنوان یکی از غنی ترین مراکز تنوع ذخایر توارثی گیاهی در جهان ساخته است.گونه های وحشی به لحاظ داشتن ژن های مفید برای مقاومت به تنش های زنده و غیرزنده و گسترش سازگاری ژنتیکی در برابر تغییرات محیطی دارای اهمیت می‌باشند. برای استفاده از این منابع، اطلاع از ماهیت و  میزان تنوع موجود در ژرم‌پلاسم، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است [108] . بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان زراعی برای برنامه های اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به هیبرید مناسب از اهمیت زیادی برخوردار است [109]. بررسی تنوع ژنتیکی همچنین از جنبه مدیریت موثر و حفظ منابع ژرم پلاسم دارای اهمیت می‌باشد [96]. روش‌هایی که برای تخمین تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته‌اند متفاوت می‌باشند. از جمله‌ی آن‌ها می توان ثبت شجره، خصوصیات مورفولوژیکی و نشانگرهای مولکولی را نام برد [41]. آگاهی از تنوع ژنتیکی ژرم‌پلاسم ها معیاری مناسب برای استفاده از آن‌ها در شناسایی و انتقال ژن‌ها در بهبود گیاهان زراعی می‌باشند [41]. تنوع ژنتیکی اساس بیشتر برنامه‌های اصلاحی بوده و انجام گزینش منوط به وجود تنوع ژنتیکی مطلوب از نظر ویژگیهای مورد بررسی می‌باشد [32]. مطالعه تنوع ژنتیکی فرآیندی است که تفاوت یا شباهت گونه‌ها، جمعیت‌ها و یا افراد را با استفاده از روش‌ها و مدل‌های آماری خاص بر اساس صفات مورفولوژیک، اطلاعات شجره‌ای یا خصوصیات مولکولی افراد بیان می‌کنند [32]. تعیین سطح تنوع ژنتیکی یکی از مراحل اساسی در مدیریت مؤثر و استفاده از ذخایر ژنتیکی می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [96،23،7]. منابع ژنتیکی یا ذخایر توارثی به دلیل اهمیت فراوانی که دارند یکی از ارزشمند ترین ثروت های ملی و منابع پایه ای در هر کشور محسوب می‌شوند [1]. یکی از عواقب اصلاح‌نباتات موفق، افزایش فرسایش یا کاهش منابع ژنتیکی گیاهی بوده که تحت برنامه انتخاب قرار گرفته‌اند. در سال های اخیر عوامل بسیار زیادی در فرسایش ژنتیکی و نابودی ذخایر ژرم‌پلاسم نقش داشته‌اند [16]. استفاده از واریته‌های اصلاح شده بجای واریته‌های بومی، اعمال روش‌های مدرن زراعی مانند استفاده از سموم علف‌کش، پیشرفت شهرها و مراکز صنعتی، مسکونی شدن زمین های زراعی و مرتعی، تغییر روش های کشت و سایر عواملی که منجر به فرسایش و انقراض مواد با ارزش می‌شوند که به‌طور مستقیم وغیر مستقیم در کشاورزی و اصلاح نباتات قابل استفاده هستند. بنابراین حفاظت و استفاده از منابع ژنتیکی گیاهی برای بقا و بهبود تولیدات زراعی ضروری بوده و به عنوان نیازی اساسی در توسعه پایدار و کاهش فقر محسوب می‌شود. تنوع ژنتیکی اساس اکثر برنامه های اصلاح نباتات می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [111،74،7]. موفقیت در اصلاح یک گیاه زراعی، در درجه اول به دسترسی تنوع ژنتیکی موجود در آن گیاه بستگی دارد، ضمن اینکه تنوع ژنتیکی یکی از ارکان اصلی کشاورزی پایدار است و وجود تنوع ژنتیکی در نظام‌های زراعی با درس گرفتن از طبیعت باید همواره مد نظر قرار گیرد. مدیریت و استفاده صحیح از تنوع موجود در ارقام محلی و خویشاوندان وحشی یک گونه گیاهی در اجرای برنامه‌های موثر اصلاحی بسیار مهم است. اولین قدم در اصلاح یک گیاه، شناسائی دقیق ساختار ژرم‌پلاسم آن گیاه است که این مطلب خود نمونه‌گیری منظم و دقیق از ژرم‌پلاسم را برای اهداف اصلاحی و حفاظتی امکان پذیر خواهد ساخت. کاهش تنوع علاوه بر کاهش بازده برنامه های اصلاحی، باعث یکنواختی ژنتیکی در مزارع و آسیب‌پذیری شدید محصولات کشاورزی در برابر آفات، بیماری‌ها و تنش‌های محیطی می‌گردد. خویشاوندان وحشی گیاهان، دربردارنده منابع ژنی با ارزش برای مقاومت به تنش‌های زنده و غیرزنده می باشند.

توده‌های وحشی و نژادهای بومی از مهم‌ترین منابع تنوع ژنتیکی در دسترس می‌باشند [26]. اهلی‌سازی جمعیت‌های برتر انتخاب شده از بین تعداد زیادی توده می‌تواند پیشرفت قابل توجهی در تأمین نیاز صنایع وابسته بدون نیاز به روش‌های پرهزینه و گران اصلاحی ایجاد نماید [26]. اهلی‌کردن، فرآیندی طولانی است، اما با انتخاب مناسب در شروع به شدت بر سرعت آن افزوده می‌شود [26]. بنابراین، با بررسی تنوع موجود، آگاهی از ساختار ژنتیکی جمعیت و بررسی تنوع فنوتیپی و ویژگی‌های شیمیایی می‌توان در بین توده‌های طبیعی به انتخاب، به‌عنوان اولین روش اصلاحی در طی اهلی‌کردن پرداخت [26]. تنوع ژنتیکی، کلیدی برای به‌نژادی گیاهان است. دانش روابط ژنتیکی بین توده‌های مختلف به مدیریت ژرم‌پلاسم کارآمد و استراتژی‌های بهره‌برداری کمک بزرگی می‌نماید. تنوع ژنتیکی گیاهان طی هزاران سال ایجاد شده و در طبیعت به صورت پایدار باقی مانده است [26].

ارقام بومی گیاهان زراعی و خویشاوندان وحشی آن‌ها، به دلیل قدمت و سازگاری‌شان به شرایط زیستی و عوامل نامسائد محیطی دارای مناسب‌ترین ژن‌ها بوده وتنوع ژنتیکی مورد نیاز اصلاح گیاه را تأمین می‌نماید [13]. تعیین میزان تنوع ژنتیکی در مواد گیاهی گام اولیه برای شناسایی، حفظ ونگهداری ذخایرتوارثی ونیز پایه اساسی و اولیه برای تحقیقات ژنتیکی و برنامه‌های اصلاحی می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [27].

گیاه  Aegilops crassa،دارای دو سیتوتیپ تتراپلوئید وهگزاپلوئید با ژنوم ( 2n=2x=28 M^crM^crD^cr1D^cr1) و (2n=6x=42 M^crM^crD^cr1D^cr1 D^cr2D^cr2  ) است [44]. تجزیه جفت شدن کروموزوم‌های میوزی در هیبریدهای بین سیتوتیپ‌های تتراپلوئید وهگزاپلوئید Ae. crassa بیانگر آن است که فرم هگزاپلوئید از هیبریداسیبون بین فرم تتراپلوئید Ae. crassa و Ae. tauschii حاصل گردیده است. اما در حال حاضر منشأ سیتوتیپ تتراپلوئید Ae. crassa را نمی‌توان با دقت تعیین کرد [69]. گیاهی یکساله و متعلق به خانواده گرامینه^[1] یا پواسه^[2] و طایفه تریتیسه^[3] می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد، این گونه به عنوان یک علف هرز شایع در مزارع گندم نان دیده می‌شود [57،56]. آژیلوپس کراسا در ترکیه، فلسطین، سوریه، اردن، ایران، عراق، لبنان، افغانستان، ترکمنستان و پامیر و کوه‌های آلتای پراکنده است، در ایران دارای دامنه پراکنش بسیار وسیعی بوده و از دامنه‌های البرز در شرق کشورتا شمال غرب در آذربایجان غربی وبر روی دامنه‌های رشته‌کوه زاگرس تا سواحل جنوبی در ارتفاعات استان بوشهر وهرمزگان می‌روید [101،40]. این گونه به عنوان یک منبع صفات مفید از قبیل تحمل به شوری، مقاومت به آفت و تحمل به سرما شناخته شده است [87،4]. مطالعه‌ی گونه‌های آژیلوپس در نقاط مختلف دنیا نشان می‌دهد که این گونه‌ها منابع ژنتیکی بی‌نظیری برای اصلاح گندم می‌باشند [33،17].

توده‌های بومی یک گیاه، ژرم‌پلاسم مناسبی برای برنامه‌های اصلاحی محسوب می‌شوند. بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان از طریق بررسی صفات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی همواره متداول بوده است. باتوجه به اینکه اندازه‌گیری صفات مورفولوژیکی نیاز به صرف وقت، انرژی و هزینه زیادی دارد و به دلیل تاثیر عوامل محیطی بر بیان ژن و بروز صفات، بررسی تنوع ژنتیکی از طریق بررسی ویژگی‌های مورفولوژیکی روش قابل اعتمادی برای تعیین تفاوت‌های ژنتیکی نیست [8]. برای بررسی تنوع ژنتیکی می‌توان از نشانگرهای مورفولوژیکی، پروتئینی و نشانگرهای مولکولی استفاده نمود [113،102]. بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان، از طریق صفات مورفولوژیکی متداول بوده است [3]. با این وجود نشانگرهای مورفولوژیکی دارای معایب زیادی می‌باشند. از جمله این که تحت تأثیر شرایط محیطی و مرحله‌ی رشد موجود قرار می‌گیرند و پایداری کمی دارند [29]. بنابراین استفاده از نشانگرهای مولکولی یکی از ابزارهای بسیار مهم و قوی در زمینه بررسی تنوع ژنتیکی و انگشت نگاریDNA می‌باشدکه در ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونه‌های مختلف کاربرد دارند [27]. همچنین استفاده از این نشانگرها در مدیریت ژرم‌پلاسم و انتخاب براساس نشانگر^[4] (MAS)، برای افزایش کارایی اصلاح و تکثیر ژرم‌پلاسم مفید می‌باشد [27]. انتخاب نوع نشانگرهای مولکولی به تکرارپذیری و سادگی روش کار آن بستگی دارد. بهترین نشانگری است که دارای هزینه اجرای پایین و قابلیت اعتماد بالایی باشد. نشانگرهای مولکولی به دو دسته نشانگرهای بیوشیمیایی و نشانگرهای مبتنی بر DNA تقسیم می‌شوند. [3]. نشانگرهای مبتنی بر DNA نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی و پروتئینی، کاربردی تر و دارای مزایای بیشتری می‌باشند. بررسی DNA گیاهی امکان ارزیابی مستقیم تنوع ژنتیکی را ممکن می‌سازد [3]. تاکنون تعداد زیادی از نشانگر‌های مبتنی بر DNA معرفی شده‌اند و در تجزیه‌های ژنتیک موجودات مورد استفاده قرار گرفته‌اند نشانگرهای مبتنی بر DNA نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی و پروتئینی، کاربردی تر و دارای مزایای بیشتری می‌باشند [28]. این نشانگر ها از نظر بسیاری از ویژگی‌ها از قبیل درجه چندشکلی^[5]، غالب^[6] یا هم بارز^[7] بودن، تعداد جایگاه‌های تجزیه‌شده در هر آزمایش، توزیع در سطح کروموزوم، تکرارپذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‌یابی DNA الگو و هزینه مورد نیاز با همدیگر متفاوت‌اند [28]. نشانگرهایی که چند شکلی را در سطح DNA آشکار می‌نمایند، به عنوان یک ابزار قدرتمند برای توصیف و تنوع ژنتیکی شناخته شده‌اند [45]. نشانگرها با توجه به استراتژی پایه گروه‌بندی شده‌اند که مهمترین آن‌ها عبارتند از: روش‌های غیر مبتنی بر PCR (RFLP و …) و تکنیک‌های مبتنی بر PCR (RAPD، AFLP و ISSR و …).